前言
酵母是我们熟知的制作面包、酒等食品的小生物。您可知道这些单细胞生命还隐藏着惊人的“变身术”！科学家发明了一种叫做“酵母细胞表面展示技术”的方法，可以让酵母细胞展示各种各样的蛋白质，就像变身超人一样拥有了各种超能力！这为快速筛选和改造蛋白质提供了巨大便利，是蛋白工程领域的一大利器。但是这个方法在筛选过程中也存在一些缺陷，限制了其进一步发挥功效。为此，一项新研究采用了名为SpyTag的特殊胶粘蛋白，使酵母细胞展示技术化身升级，进一步提升了筛选蛋白质的速度和效率，为蛋白工程开辟了光明前景。
酵母细胞表面展示技术是什么魔法?
酵母表面展示技术是将目标蛋白质与特殊的蛋白锚定基团融合，并展示在酵母细胞表面。这就像给酵母穿上了一件针对不同目标设计的盔甲，让酵母获得了显示和固定各种蛋白质的超能力。这种方法有以下三大优势：
①、可以快速检测表面蛋白质的活性和特性。就像给蛋白质做体检一样，一目了然。
②、利用酵母自身的蛋白质生产机器帮助正确折叠蛋白质。像一个小工厂进行质量控制。
③、容易筛选和改造蛋白质。像对超人进行升级优化。
正因为这些好处，酵母表面展示技术被广泛应用于抗体和酶蛋白的筛选、活性改造等研究，是蛋白工程的绝佳平台。
传统方法也存在短板
然而，传统的酵母表面展示技术在应用中也存在一些不足。最大的问题是目标蛋白和锚定蛋白以融合的形式共同编码，容易同时受到突变影响。
在进行筛选和改造蛋白质的“生物连续进化”过程中，我们需要对目标蛋白基因进行大量的定点突变，而锚定蛋白也可能被误改变。这会导致锚定蛋白的结构和功能受到影响，进而使目标蛋白无法正确展示和固定在酵母表面。
这样一来，酵母的“变身术”就失效了，我们得不到想要筛选的优化蛋白质。这成为了传统方法的致命软肋。为了进一步发挥这项技术的强大威力，我们需要想办法避免锚定蛋白发生突变。
生物胶粘“Spy”诞生了酵母升级版
在自然界中,存在一种特殊的生物胶水，可以在两种蛋白质之间形成极其牢固的连接，这就是SpyTag和SpyCatcher系统。SpyCatcher中含有一种特殊氨基酸，可以与SpyTag中的另一种氨基酸快速结合，两者就像胶水一样粘在了一起。
SpyTag/SpyCatcher系统是通过裂解化脓性链球菌纤连蛋白结合蛋白FbaB（具有内部异肽键）的CnaB2结构域而开发的。SpyCatcher包含反应性Lys和催化性Glu，而SpyTag包含反应性Asp，SpyCatcher和SpyTag之间生成异肽键，形成共价结合复合物。SpyTag/SpyCatcher系统已用于将外来蛋白质固定到纳米颗粒和细菌外膜囊泡上。
图1 通过SpyTag/SpyCatcher基于蛋白质连接的纳米抗体在酵母细胞表面展示。
(a) 传统和 (b) 基于SpyTag/SpyCatcher的酵母细胞表面展示示意图。星号表示SpyCatcher和SpyTag之间发生的细胞内异肽键形成。SpyCatcher中的Lys31和SpyTag中的Asp117之间的反应如图中小窗口所示。
科学家灵机一动，将这套天然的胶粘系统应用到酵母表面展示技术中。他们设计了两个独立的质粒：一个编码带有SpyTag的目标蛋白。另一个编码带有SpyCatcher的锚定蛋白（图1）。
这样,两者在酵母细胞内分别表达后，就通过SpyTag和SpyCatcher之间的胶粘特性连接在了一起。最后这个融合复合体被展示到酵母表面。
这样一来，目标蛋白和锚定蛋白分开编码，就可以避免锚定蛋白的突变影响目标蛋白的展示。这就像给酵母换上了升级装备，优化了其超能力。
升级版展示技术效果如何?
科学家进行了一系列验证来检测新方法的效果：
优异的展示效率
检测发现，利用酵母整合质粒制造SpyCatcher锚定蛋白、利用酵母核质粒制造目标蛋白-SpyTag的方案展示效率可高达90%（图2）。证明新方法的连接和展示效率极高。
图2. 通过选择最佳的质粒系统来提高显示效率，以产生SpyCatcher锚定蛋白。
用于负对照酵母的质粒，在免疫染色和流式细胞术中用于指示非特异性吸附，不含纳米抗体编码序列和HA标签；相反，它含有FLAG标签。每个样本都用小鼠抗-HA标签抗体-AF488偶联的抗小鼠抗体和AF647标记的溶菌酶染色。（a）流式细胞术分析的密度图。酵母细胞比例显示在每个图表的右上角（UR）。所示数据代表三次独立实验的结果。
避免细胞间连接
通过荧光显微镜观察发现，不同酵母细胞之间并没有出现蛋白质的错位连接现象。这确保了目标蛋白仅存在于其编码的特定酵母细胞上，有利于后续的准确筛选。
优异的通用性
测试了5种不同的随机抗体，结果显示均可高效地表面展示，并正确发挥特异性识别作用。这说明新方法对目标蛋白均具有很好的适用性。
具有高效富集能力
利用流式细胞仪可以在一次筛选中高效富集目标酵母细胞，为后续快速优化奠定坚实基础。
可以看出，新方法不仅展示效率高，还规避了锚定蛋白突变的风险，尤其适合于生物进化筛选。它就像给酵母换上了升级装备，使其表面展示的超能力更加强大！
美好前景：快速优化蛋白质的“进化工厂”
该研究成功构建了一个卓越的酵母表面展示和筛选系统。科学家期待这套系统能够与生物进化技术相结合，建立一个蛋白质的快速“进化工厂”：在酵母细胞内高效引入变异，每2-3天进行一次筛选，在2-3周内完成蛋白质的快速定向优化。
小结
相比传统方式，这种生物进化筛选系统可以以超过10倍的速度获得增强效果。它将大大推进抗体和酶蛋白等各类蛋白工程的研究进程，也许很快就能孕育出更多对人类有利的“蛋白质生化战士”！
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参考文献：